Princip NGS metody
Next Generation Sequencing (NGS – sekvenování nové generace) je v posledních letech jednou z nejrychleji se rozvíjejících metod v oblasti diagnostiky různých onemocnění. Společně s vývojem techniky se posouvají i hranice požadavků na kvalitu zpracování vzorku, požadavků na vstupní materiál a zejména kvalitu analyzovaných dat. NGS se postupně stává metodou, která opouští prostředí experimentálních laboratoří a přesouvá se do rutinní praxe v klinické sféře.
Výhodou NGS je rychlé a relativně nenáročné zpracování jednotlivých vzorků. Vlastní procesy sekvenování obstarává většinou plně sekvenátor a největší část práce tak připadá na závěrečné vyhodnocení dat. Pro rutinní použití jakéhokoliv NGS kitu je nezbytný uživatelsky jednoduchý software generující spolehlivý výsledek.
Metoda Next Generation Sequencing umožňuje sekvenovat úseky nukleových kyselin až celých genomů podstatně rychleji a cenově výhodněji než ostatní sekvenační metody.[1],[2],[3],[4],[5] Podstatou je zpracovávání tisíců až milionů sekvencí současně v jednom běhu, což má za následek produkci obrovského množství výstupních dat. Nejčastěji používanými metodami je amplikonové sekvenování a ‘enrichment’.
Amplikonové sekvenování využívá přesně navržených primerů pro konkrétní úseky DNA. Délka získaných sekvencí se pohybuje mezi 50-300 bp. U takto krátkých fragmentů se můžeme efektivně zaměřit na konkrétní změny v jednotlivých bazích genů nebo jejich úseků, které mohou být asociované s určitým onemocněním.
Typické použití této techniky je při sekvenování většího počtu vzorků při screeningu např. nádorových chorob. V klinickém prostředí je dále využíváno pro odhalování somatických mutací v komplexních vzorcích, tj. takových, které obsahují buňky s nádorovou i normální DNA (např. biopsie).[6] V současné době je možné provádět sekvenování nejen ze vzorků biopsie, ale i ze vzorků plazmy, které obsahují cirkulující nádorovou DNA. Tato metoda je pro pacienta minimálně invazivní.
Enrichment sekvenování pracuje taktéž s jednotlivými fragmenty, jejich délka je však řádově vyšší, proto je vhodné jej využívat u celogenomového de novo sekvenování, případně resekvenování. Výhoda dlouhých čtení je jednoznačná v případě snahy nalézt mutace nové, či velmi vzácné.
Do sekvenační reakce vstupují vzorky v souboru, tzv. knihovně. Její příprava zahrnuje proces přípravy templátu, tvorbu vlastní knihovny, která je amplifikována, purifikována a analyzována.
Získání templátu zahrnuje izolaci DNA a přípravu již zmíněných amplikonů. Takto získaný materiál, tj. sady fragmentů/molekul DNA, je označen speciálními sekvenačními adaptory a specifickými molekulárními barcody, které umožňují vzorky vzájemně odlišit. V jedné reakci je proto možné zahrnout vzorky až šedesáti pacientů, což šetří čas i náklady oproti zpracování vzorků jednotlivě pomocí jiných metod. Takto vytvořená knihovna je poté amplifikována, tedy od jednotlivých fragmentů získáváme tisíce přesných klonů. To je důležité pro následující proces sekvenování, kdy jsou všechny fragmenty přečteny sekvenátorem a přiřazeny k sobě na základě identifikátoru. Tisíce vstupních klonů pro jeden fragment umožní identifikovat bázi na pozici s vysokou přesností.
Autor: Marcela Novotná
Zveřejněno: listopad 2018
[1] SLABÝ, Ondřej. Molekulární medicína. 1.. vydání. Galén, 2015. 598 s. ISBN 9788074921216.
[2] https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/186/4483.pdf
[3] https://is.muni.cz/el/1431/jaro2015/Bi7250/um/PrF5_2015.pdf
[4] https://www.news-medical.net/life-sciences/Sanger-and-next-generation-compared.aspx
[5] https://www.thelancet.com/action/showPdf?pii=S0140-6736%2816%2932322-4
[6] https://www.linkos.cz/files/klinicka-onkologie/186/4483.pdf